在mRNA疫苗與核酸治療領域，脂質納米顆粒（LNP）是實現核酸分子高效遞送的核心載體，而脂質材料更是決定LNP遞送效率與生物安全性的關鍵。但長期以來，mRNA的固有不穩(wěn)定性導致LNP制劑需低溫儲存，冷凍-解凍（F-T）過程中產生的冰晶與滲透壓應力，易引發(fā)LNP聚集、mRNA泄漏等問題，嚴重制約其應用落地。
mRNA遞送系統(tǒng)輔料_mRNA遞送-廈門賽諾邦格生物科技股份有限公司中國科學院化學研究所的團隊在《Nature Communications》發(fā)表研究，提出一種全新解決方案：利用冷凍濃縮現象，讓甜菜堿類冷凍保護劑（CPA）主動融入LNP，不僅能維持制劑穩(wěn)定性，更能顯著增強mRNA遞送效率。該研究為脂質材料的制劑優(yōu)化提供了全新思路。
研究背景
mRNA對水解、氧化及酶解極為敏感，必須在零下溫度儲存以維持穩(wěn)定性，臨床常用的mRNA-1273、BNT162b2疫苗均采用蔗糖作為冷凍保護劑。但即使添加保護劑，冷凍-解凍過程仍存在兩大核心問題：
? 物理穩(wěn)定性破壞：冰晶形成與滲透壓變化會導致LNP融合、聚集，破壞其球形結構與粒徑均一性。
? 遞送效率下降：LNP結構破壞會引發(fā)mRNA泄漏，同時內體逃逸能力減弱，最終導致靶細胞內mRNA表達效率大幅降低。
現有研究多聚焦于“被動穩(wěn)定”LNP，而本研究的創(chuàng)新點在于：主動利用冷凍-解凍過程本身，讓冷凍保護劑從“穩(wěn)定劑”升級為“功能增強劑”，實現穩(wěn)定性與遞送效率的雙重提升。
冷凍濃縮驅動BT-CPA融入LNP
研究者團隊開發(fā)了由甜菜堿（betaine）和海藻糖（trehalose）組成的復合冷凍保護劑（BT-CPA），通過一系列實驗證實：冷凍過程可誘導BT-CPA主動融入LNP內部，同時實現兩大效果：① 維持LNP在冷凍-解凍后的結構完整性；② 增強LNP的內體逃逸能力，提升mRNA遞送效率。
均聚物_聚兩性離子-廈門賽諾邦格生物科技股份有限公司多糖（普通多糖，比如原始的透明質酸）_糖類-廈門賽諾邦格生物科技股份有限公司
冷凍過程中，水分會形成冰晶，導致剩余液相中LNP與冷凍保護劑濃度急劇升高，這一現象被稱為“冷凍濃縮”。該過程會在LNP膜兩側形成陡峭的濃度梯度，驅動甜菜堿和海藻糖通過脂質膜的瞬時縫隙（由冰晶機械應力與脂質相變引發(fā)）被動擴散進入LNP內部。
研究者通過質子核磁共振和高分辨質譜驗證了這一機制：經冷凍-解凍處理的LNP+BT-CPA樣品，在透析去除外部游離BT-CPA后，仍能檢測到甜菜堿（特征峰3.28 ppm、3.83 ppm）和海藻糖（特征峰3.34 ppm等）的特征信號；而未經過冷凍-解凍的LNP+BT-CPA樣品，幾乎無BT-CPA封裝。這表明冷凍是BT-CPA融入LNP的必要條件，而非簡單的表面吸附。
BT-CPA的優(yōu)化：濃度與配比的精準調控
為平衡穩(wěn)定性與遞送效率，研究者對BT-CPA的配比和濃度進行了系統(tǒng)優(yōu)化：
1. 復合配比優(yōu)化：單獨使用25 mg/mL甜菜堿雖能維持LNP穩(wěn)定性，但mRNA封裝效率略低于87 mg/mL蔗糖；添加25 mg/mL海藻糖后（即BT-CPA：甜菜堿25 mg/mL + 海藻糖25 mg/mL），LNP經冷凍-解凍后粒徑變化極小，mRNA封裝效率穩(wěn)定，且遞送效率較單獨甜菜堿組提升1.4倍，較新鮮LNP提升2.4倍。
2. 濃度閾值效應：當甜菜堿濃度從10 mg/mL提升至25 mg/mL時，mRNA遞送效率顯著升高；但進一步提升至75 mg/mL時，效率不再增加，因此25 mg/mL為最優(yōu)濃度。
3. 冷凍-解凍循環(huán)次數優(yōu)化：1-2次循環(huán)可提升遞送效率，且不破壞LNP結構；6次循環(huán)則會導致LNP聚集、mRNA泄漏，效率下降，因此2次循環(huán)為最優(yōu)條件。
BT-CPA增強mRNA遞送：提升內體逃逸能力
研究者通過細胞實驗和機制驗證，明確了BT-CPA提升遞送效率的核心路徑：不影響細胞攝取，而是通過增強內體逃逸能力提升mRNA表達。
1. 細胞攝取無差異，內體逃逸顯著增強：流式細胞術分析顯示，經BT-CPA處理并冷凍-解凍的SM-102-LNP（BT-CPA-LNP）與新鮮SM-102-LNP的細胞攝取效率幾乎一致（無統(tǒng)計學差異）；但共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現，BT-CPA-LNP組中，Cy5標記的mRNA（紅色）與溶酶體標記物（綠色）的重疊度顯著降低，Pearson相關系數（PCC）顯著低于新鮮LNP組，表明內體逃逸能力顯著增強。
2. 分子機制：甜菜堿的質子化介導膜融合：甜菜堿作為兩性離子分子，在酸性內體環(huán)境中會發(fā)生質子化，轉化為帶正電的物質，與帶負電的內體膜發(fā)生靜電相互作用，促進膜融合。研究者通過膜融合實驗驗證了這一機制：使用NBD-PE和Rhod-PE標記的模型內體，當LNP與內體融合時，NBD的熒光會因FRET效應解除而增強；結果顯示，BT-CPA-LNP組的NBD熒光強度顯著高于新鮮LNP組，證實其膜融合能力更強。
3. 普適性驗證：適配多種脂質：關鍵亮點在于，BT-CPA的增強效應并非局限于SM-102一種脂質，而是對多種臨床常用可電離脂質均適用。研究者分別以ALC-0315、MC3等脂質為核心脂質制備LNP，經BT-CPA處理并冷凍-解凍后，所有LNP的mRNA遞送效率均顯著提升，且粒徑均維持在200 nm以下，PDI＜0.2，證明該策略對不同LNP制劑具有廣泛適配性。
體內驗證：更強免疫反應與劑量節(jié)約優(yōu)勢
在C57BL/6小鼠體內實驗中，BT-CPA-LNP展現出顯著的體內優(yōu)勢：
? mRNA表達效率更高：肌內注射后4 h和24 h，BT-CPA-LNP組的熒光素酶表達強度分別是新鮮LNP組的2.3倍和1.7倍。
? 免疫反應更強：封裝卵清蛋白mRNA（mOVA）的BT-CPA-LNP，在0.1 μg和1 μg兩個劑量下，誘導的OVA特異性IgG抗體滴度均顯著高于新鮮LNP組；ELISpot實驗顯示，其誘導的IFN-γ陽性CD4?和CD8? T細胞數量也顯著更多。
? 長期穩(wěn)定性優(yōu)異：在-80 °C儲存6個月后，BT-CPA-LNP仍能維持較高的mRNA表達效率，且細胞毒性極低（各濃度下DC2.4細胞存活率均＞90%）。
研究意義
研究的突破不僅在于提出了一種新型LNP冷凍保護策略，更顛覆了行業(yè)對“冷凍保護劑”的認知——冷凍保護劑不再是單純的“穩(wěn)定劑”，而是可通過冷凍過程主動融入LNP，成為調控其功能的“活性成分”。
該研究具有三大核心價值：
1.優(yōu)化制劑儲存方案：解決了LNP低溫儲存與運輸中的穩(wěn)定性難題，為mRNA疫苗和核酸藥物的全球化配送提供了技術支撐。
2.拓展核心脂質應用場景：證實SM-102、ALC-0315、MC3等脂質材料可通過BT-CPA策略進一步提升遞送效率，為其在癌癥免疫治療、罕見病基因治療等領域的應用提供了優(yōu)化方向。
3.創(chuàng)新制劑研發(fā)思路：開創(chuàng)了“利用冷凍過程實現功能增強”的制劑設計理念，為后續(xù)LNP制劑的創(chuàng)新研發(fā)提供了全新范式。
結語
中科院化學研究所的這項研究，通過對冷凍過程的精準利用，成功將LNP的“儲存痛點”轉化為“功能亮點”，為SM-102、ALC-0315、MC3等核心脂質材料的制劑優(yōu)化提供了極具應用價值的技術方案，這將為更多疾病治療帶來新希望。
賽諾邦格可供應研究中所使用的脂質（SM-102、ALC-0315、MC3），提供一站式脂質體輔料，擁有多種自主知識產權脂質輔料可供客戶選擇。此外，我們還提供高品質的多糖及聚兩性離子產品，以滿足多樣化的研發(fā)與生產需求。
Reference：
Cheng X, Zheng X, Tao K, et al. Freezing induced incorporation of betaine in lipid nanoparticles enhances mRNA delivery[J]. Nature Communications, 2025, 16(1): 4700.
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