在mRNA疫苗與核酸治療領(lǐng)域，脂質(zhì)納米顆粒（LNP）是實(shí)現(xiàn)核酸分子高效遞送的核心載體，而脂質(zhì)材料更是決定LNP遞送效率與生物安全性的關(guān)鍵。但長(zhǎng)期以來(lái)，mRNA的固有不穩(wěn)定性導(dǎo)致LNP制劑需低溫儲(chǔ)存，冷凍-解凍（F-T）過(guò)程中產(chǎn)生的冰晶與滲透壓應(yīng)力，易引發(fā)LNP聚集、mRNA泄漏等問(wèn)題，嚴(yán)重制約其應(yīng)用落地。
mRNA遞送系統(tǒng)輔料_mRNA遞送-廈門賽諾邦格生物科技股份有限公司中國(guó)科學(xué)院化學(xué)研究所的團(tuán)隊(duì)在《Nature Communications》發(fā)表研究，提出一種全新解決方案：利用冷凍濃縮現(xiàn)象，讓甜菜堿類冷凍保護(hù)劑（CPA）主動(dòng)融入LNP，不僅能維持制劑穩(wěn)定性，更能顯著增強(qiáng)mRNA遞送效率。該研究為脂質(zhì)材料的制劑優(yōu)化提供了全新思路。
研究背景
mRNA對(duì)水解、氧化及酶解極為敏感，必須在零下溫度儲(chǔ)存以維持穩(wěn)定性，臨床常用的mRNA-1273、BNT162b2疫苗均采用蔗糖作為冷凍保護(hù)劑。但即使添加保護(hù)劑，冷凍-解凍過(guò)程仍存在兩大核心問(wèn)題：
? 物理穩(wěn)定性破壞：冰晶形成與滲透壓變化會(huì)導(dǎo)致LNP融合、聚集，破壞其球形結(jié)構(gòu)與粒徑均一性。
? 遞送效率下降：LNP結(jié)構(gòu)破壞會(huì)引發(fā)mRNA泄漏，同時(shí)內(nèi)體逃逸能力減弱，最終導(dǎo)致靶細(xì)胞內(nèi)mRNA表達(dá)效率大幅降低。
現(xiàn)有研究多聚焦于“被動(dòng)穩(wěn)定”LNP，而本研究的創(chuàng)新點(diǎn)在于：主動(dòng)利用冷凍-解凍過(guò)程本身，讓冷凍保護(hù)劑從“穩(wěn)定劑”升級(jí)為“功能增強(qiáng)劑”，實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定性與遞送效率的雙重提升。
冷凍濃縮驅(qū)動(dòng)BT-CPA融入LNP
研究者團(tuán)隊(duì)開發(fā)了由甜菜堿（betaine）和海藻糖（trehalose）組成的復(fù)合冷凍保護(hù)劑（BT-CPA），通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)證實(shí)：冷凍過(guò)程可誘導(dǎo)BT-CPA主動(dòng)融入LNP內(nèi)部，同時(shí)實(shí)現(xiàn)兩大效果：① 維持LNP在冷凍-解凍后的結(jié)構(gòu)完整性；② 增強(qiáng)LNP的內(nèi)體逃逸能力，提升mRNA遞送效率。
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冷凍過(guò)程中，水分會(huì)形成冰晶，導(dǎo)致剩余液相中LNP與冷凍保護(hù)劑濃度急劇升高，這一現(xiàn)象被稱為“冷凍濃縮”。該過(guò)程會(huì)在LNP膜兩側(cè)形成陡峭的濃度梯度，驅(qū)動(dòng)甜菜堿和海藻糖通過(guò)脂質(zhì)膜的瞬時(shí)縫隙（由冰晶機(jī)械應(yīng)力與脂質(zhì)相變引發(fā)）被動(dòng)擴(kuò)散進(jìn)入LNP內(nèi)部。
研究者通過(guò)質(zhì)子核磁共振和高分辨質(zhì)譜驗(yàn)證了這一機(jī)制：經(jīng)冷凍-解凍處理的LNP+BT-CPA樣品，在透析去除外部游離BT-CPA后，仍能檢測(cè)到甜菜堿（特征峰3.28 ppm、3.83 ppm）和海藻糖（特征峰3.34 ppm等）的特征信號(hào)；而未經(jīng)過(guò)冷凍-解凍的LNP+BT-CPA樣品，幾乎無(wú)BT-CPA封裝。這表明冷凍是BT-CPA融入LNP的必要條件，而非簡(jiǎn)單的表面吸附。
BT-CPA的優(yōu)化：濃度與配比的精準(zhǔn)調(diào)控
為平衡穩(wěn)定性與遞送效率，研究者對(duì)BT-CPA的配比和濃度進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化：
1. 復(fù)合配比優(yōu)化：?jiǎn)为?dú)使用25 mg/mL甜菜堿雖能維持LNP穩(wěn)定性，但mRNA封裝效率略低于87 mg/mL蔗糖；添加25 mg/mL海藻糖后（即BT-CPA：甜菜堿25 mg/mL + 海藻糖25 mg/mL），LNP經(jīng)冷凍-解凍后粒徑變化極小，mRNA封裝效率穩(wěn)定，且遞送效率較單獨(dú)甜菜堿組提升1.4倍，較新鮮LNP提升2.4倍。
2. 濃度閾值效應(yīng)：當(dāng)甜菜堿濃度從10 mg/mL提升至25 mg/mL時(shí)，mRNA遞送效率顯著升高；但進(jìn)一步提升至75 mg/mL時(shí)，效率不再增加，因此25 mg/mL為最優(yōu)濃度。
3. 冷凍-解凍循環(huán)次數(shù)優(yōu)化：1-2次循環(huán)可提升遞送效率，且不破壞LNP結(jié)構(gòu)；6次循環(huán)則會(huì)導(dǎo)致LNP聚集、mRNA泄漏，效率下降，因此2次循環(huán)為最優(yōu)條件。
BT-CPA增強(qiáng)mRNA遞送：提升內(nèi)體逃逸能力
研究者通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和機(jī)制驗(yàn)證，明確了BT-CPA提升遞送效率的核心路徑：不影響細(xì)胞攝取，而是通過(guò)增強(qiáng)內(nèi)體逃逸能力提升mRNA表達(dá)。
1. 細(xì)胞攝取無(wú)差異，內(nèi)體逃逸顯著增強(qiáng)：流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，經(jīng)BT-CPA處理并冷凍-解凍的SM-102-LNP（BT-CPA-LNP）與新鮮SM-102-LNP的細(xì)胞攝取效率幾乎一致（無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異）；但共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，BT-CPA-LNP組中，Cy5標(biāo)記的mRNA（紅色）與溶酶體標(biāo)記物（綠色）的重疊度顯著降低，Pearson相關(guān)系數(shù)（PCC）顯著低于新鮮LNP組，表明內(nèi)體逃逸能力顯著增強(qiáng)。
2. 分子機(jī)制：甜菜堿的質(zhì)子化介導(dǎo)膜融合：甜菜堿作為兩性離子分子，在酸性內(nèi)體環(huán)境中會(huì)發(fā)生質(zhì)子化，轉(zhuǎn)化為帶正電的物質(zhì)，與帶負(fù)電的內(nèi)體膜發(fā)生靜電相互作用，促進(jìn)膜融合。研究者通過(guò)膜融合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這一機(jī)制：使用NBD-PE和Rhod-PE標(biāo)記的模型內(nèi)體，當(dāng)LNP與內(nèi)體融合時(shí)，NBD的熒光會(huì)因FRET效應(yīng)解除而增強(qiáng)；結(jié)果顯示，BT-CPA-LNP組的NBD熒光強(qiáng)度顯著高于新鮮LNP組，證實(shí)其膜融合能力更強(qiáng)。
3. 普適性驗(yàn)證：適配多種脂質(zhì)：關(guān)鍵亮點(diǎn)在于，BT-CPA的增強(qiáng)效應(yīng)并非局限于SM-102一種脂質(zhì)，而是對(duì)多種臨床常用可電離脂質(zhì)均適用。研究者分別以ALC-0315、MC3等脂質(zhì)為核心脂質(zhì)制備LNP，經(jīng)BT-CPA處理并冷凍-解凍后，所有LNP的mRNA遞送效率均顯著提升，且粒徑均維持在200 nm以下，PDI＜0.2，證明該策略對(duì)不同LNP制劑具有廣泛適配性。
體內(nèi)驗(yàn)證：更強(qiáng)免疫反應(yīng)與劑量節(jié)約優(yōu)勢(shì)
在C57BL/6小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，BT-CPA-LNP展現(xiàn)出顯著的體內(nèi)優(yōu)勢(shì)：
? mRNA表達(dá)效率更高：肌內(nèi)注射后4 h和24 h，BT-CPA-LNP組的熒光素酶表達(dá)強(qiáng)度分別是新鮮LNP組的2.3倍和1.7倍。
? 免疫反應(yīng)更強(qiáng)：封裝卵清蛋白mRNA（mOVA）的BT-CPA-LNP，在0.1 μg和1 μg兩個(gè)劑量下，誘導(dǎo)的OVA特異性IgG抗體滴度均顯著高于新鮮LNP組；ELISpot實(shí)驗(yàn)顯示，其誘導(dǎo)的IFN-γ陽(yáng)性CD4?和CD8? T細(xì)胞數(shù)量也顯著更多。
? 長(zhǎng)期穩(wěn)定性優(yōu)異：在-80 °C儲(chǔ)存6個(gè)月后，BT-CPA-LNP仍能維持較高的mRNA表達(dá)效率，且細(xì)胞毒性極低（各濃度下DC2.4細(xì)胞存活率均＞90%）。
研究意義
研究的突破不僅在于提出了一種新型LNP冷凍保護(hù)策略，更顛覆了行業(yè)對(duì)“冷凍保護(hù)劑”的認(rèn)知——冷凍保護(hù)劑不再是單純的“穩(wěn)定劑”，而是可通過(guò)冷凍過(guò)程主動(dòng)融入LNP，成為調(diào)控其功能的“活性成分”。
該研究具有三大核心價(jià)值：
1.優(yōu)化制劑儲(chǔ)存方案：解決了LNP低溫儲(chǔ)存與運(yùn)輸中的穩(wěn)定性難題，為mRNA疫苗和核酸藥物的全球化配送提供了技術(shù)支撐。
2.拓展核心脂質(zhì)應(yīng)用場(chǎng)景：證實(shí)SM-102、ALC-0315、MC3等脂質(zhì)材料可通過(guò)BT-CPA策略進(jìn)一步提升遞送效率，為其在癌癥免疫治療、罕見(jiàn)病基因治療等領(lǐng)域的應(yīng)用提供了優(yōu)化方向。
3.創(chuàng)新制劑研發(fā)思路：開創(chuàng)了“利用冷凍過(guò)程實(shí)現(xiàn)功能增強(qiáng)”的制劑設(shè)計(jì)理念，為后續(xù)LNP制劑的創(chuàng)新研發(fā)提供了全新范式。
結(jié)語(yǔ)
中科院化學(xué)研究所的這項(xiàng)研究，通過(guò)對(duì)冷凍過(guò)程的精準(zhǔn)利用，成功將LNP的“儲(chǔ)存痛點(diǎn)”轉(zhuǎn)化為“功能亮點(diǎn)”，為SM-102、ALC-0315、MC3等核心脂質(zhì)材料的制劑優(yōu)化提供了極具應(yīng)用價(jià)值的技術(shù)方案，這將為更多疾病治療帶來(lái)新希望。
賽諾邦格可供應(yīng)研究中所使用的脂質(zhì)（SM-102、ALC-0315、MC3），提供一站式脂質(zhì)體輔料，擁有多種自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)脂質(zhì)輔料可供客戶選擇。此外，我們還提供高品質(zhì)的多糖及聚兩性離子產(chǎn)品，以滿足多樣化的研發(fā)與生產(chǎn)需求。
Reference：
Cheng X, Zheng X, Tao K, et al. Freezing induced incorporation of betaine in lipid nanoparticles enhances mRNA delivery[J]. Nature Communications, 2025, 16(1): 4700.
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